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        鉛暴露大鼠腦不同區域NMDA受體表達的研究

        基金項目:遼寧省科學技術基金項目(No.20041033)
        作者單位:沈陽醫學院,遼寧沈陽110034;沈陽市鐵西區疾控中心理化實驗室
        vestigation on the Expression of NMDA Receptor Subunit (NR1、NR2A、NR2B) in Different Brain Areas of Plumbum Exposure Rats
        ZHU Qiwen, ZHANG Qi(Shenyang Medical College, Shenyang 110034,China;Physics&hemistry Clinical Laboratory, Diseases Control Centre of Tiexi District of Shenyang)
        【摘要】目的:觀察鉛暴露大鼠中不同腦區NMDAR1(NR1)、NMDAR2A(NR2A)和NMDAR2B(NR2B)亞基蛋白和mRNA水平的表達情況。方法:采用Western Blot及RTPCR技術,測定NR1、NR2A和NR2B亞基蛋白和mRNA在鉛暴露大鼠腦中額葉皮質、新小腦、海馬及紋狀體中的表達情況。結果:鉛暴露大鼠中NR1、NR2A和NR2B亞基的蛋白水平和mRNA表達在各個腦區均有不同程度的下調。結論:在鉛暴露大鼠的額葉皮質、海馬、新小腦和紋狀體中,NMDA受體亞基NR1,NR2A和NR2B的表達在mRNA水平就已經發生了改變。
        【關鍵詞】 AD(Alzheimer,s disease,阿爾茨海默癥);NR1亞基;NR2A亞基;NR2B亞基 
        Abstract  Objective:To investigate the change ofNMDAR1(NR1),NMDAR2A(NR2A)and NMDAR2B(NR2B)subunit expression in the different brain region of plumbum exposure rat.Methods:Western blot technique and RT-PCR technique were used to determine the expression of NR1,NR2A and NR2B subunit protein and mRNA expression in Pb exposure rats brain cortex of frontal lobe, neocerebellum, hippocampus and corpora.Results:The levels of NR1, NR2A and NR2B subunit protein and mRNAs expression in different regions of the brain from Pb exposure rats had different degree down regulation. Conclusion:The expression of NMDA receptor subunit NR1,NR2A and NR2B had changed at mRNA level in the cortex of frontal lobe,neocerebellum,hippocampus and corpora striata from Pb exposure rats.
        Key words  Alzheimers disease ( AD) ;NR1 subunit; NR2A subunit; NR2B subunit
          N-甲基-D-天門冬氨酸(NmethyD-aspartate,NMDA)受體是離子型谷氨酸(Glutamatic acid)受體的一個亞型,通過對其藥理、生理、病理等方面的研究已經證實,NMDA受體在生物發育過程中有著重要的生理作用,可調節神經元的活性,樹突、軸突結構的發育及突觸可塑性等,在神經元回路的形成及學習和記憶的突觸機制中,NMDA受體也起著關鍵作用[1~4]。正常神經系統的發育需要興奮性氨基酸受體活性處于最佳水平,如果NMDA受體活性過低則可能使發育延遲,而活性過高又可能導致神經元損傷或腦損傷[5~7]。本研究采用了鉛暴露大鼠模型,研究NMDA受體在鉛暴露大鼠學習記憶障礙中的變化,探討其可能的機制。
          1 材料與方法
          1.1  動物及模型制備40只一月齡SpragueDawley(SD)大鼠由沈陽醫學院實驗動物中心提供,雌雄不拘,體重(120±15)g,隨機分成5組,各8只。鉛暴露組分飼0.1%、0.2%、0.5%、1.0%用蒸餾水配制的醋酸鉛溶液,對照組給予蒸餾水。3周后娩出子鼠,子鼠21天起斷乳,喂以母鼠相同的飲水并單獨飼養。當母鼠18個月齡時,采用朱啟文等先前報道過的大鼠多功能行為訓練裝置[8],在術前及術后14d開始被動回避反應(passive avoidance response,PAR)訓練。將鉛暴露大鼠模型合格者處死取腦標本進行下列實驗。
          1.2  方法
          1.2.1  Western Blot  分析  (1)試劑:NR1、NR2A多克隆抗體購于santa cruz公司;NR2B購于博士德生物工程有限公司;辣根過氧化物酶標記兔抗羊和羊抗兔抗體購于中山公司。(2)樣品處理:取大鼠不同腦區標本,切取一部分,裂解腦組織提取總蛋白。上樣,電泳,濕轉至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉。將PVDF膜在置于4℃NMDA受體雜交液(1:500)中搖床過夜,然后在過氧化物酶標記二抗(IgG)雜交液(1:5000)中孵育1h。最后ECL發光顯影。
          1.2.2  組織總RNA的提取及RTPCR(1)試劑:RNeasy Mini Kit試劑盒購于QIAGEN公司。RTPCR試劑盒購于Takara公司。(2)樣品處理:按試劑盒步驟提取總RNA,紫外分光光度計測定,計算總RNA的濃度。反轉錄后以βactin為內參進行擴增。PCR擴增片斷長度為:NR1463bp,NR2A421bp,NR2B651bp,βactin445bp。取PCR產物經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后染色,成像。
           1.3  統計學分析采用t檢驗進行統計學處理。
          2  結果
          2.1  Western Blot結果鉛暴露大鼠海馬區NR1、NR2A、NR2B亞基蛋白表達明顯減弱,額葉皮質和紋狀體次之,經統計學處理差異有顯著性(P<0.05),新小腦區無明顯減弱(P<0.5)(圖1~3)。
          2.2  RTPCR檢測結果正常對照組大鼠NR1、NR2A亞基mRNA表達新小腦較強(P<0.05),其余各區無差異,NR2B亞基mRNA額葉皮質及新小腦表達較強(P<0.05)。鉛暴露大鼠組三種亞基的mRNA表達均有不同程度的下調。鉛暴露大鼠中各區NR1亞基mRNA表達均有所降低,其下調趨勢趨于一致(P<0.05)(圖4);NR2A亞基mRNA在鉛暴露大鼠中額葉皮質、新小腦區、海馬及紋狀體的表達下調趨勢均很明顯(P<0.05)(圖5);NR2B亞基在額葉皮質、新小腦區的表達趨勢下降最顯著,紋狀體次之(P<0.05),海馬最次之(圖6)。   
          3  討論
          興奮性氨基酸(EAA)受體有三種亞型:海人草酸(KA)受體,使君子氨酸(QA)受體和N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體。NMDA受體通道只在學習記憶過程中才開啟,因此被認為是學習記憶中的關鍵物質。NMDA受體不僅調節Na+、K+通道,還控制Ca2+通道。當被激活時,有跨膜Na+K+流動,也有大量Ca2+流入胞內。Ca2+可作為第二信使,可能直接或間接使膜受體發生改變,從而改變突觸效率,產生記憶[9]。
          Martin等報道,利用Western Blott方法證實16位AD患者死后大腦四個不同腦區NR1,NR2A和NR2B蛋白磷酸化水平與患者死前認知反應行為測試正相關,且NR1和NR2B在海馬減少,在枕葉及尾核卻未見減少[10,11]。
          圖1  鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR1亞基Westernblot檢測結果(略)
          圖2  鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR2A亞基Western blot檢測結果(略)
          圖3  鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR2B亞基Western blot檢測結果(略)
          圖4鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR1亞基RTPCR檢測結果(略)
          圖5  鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR2A亞基RTPCR檢測結果(略)
          圖6  鉛暴露大鼠和正常對照大鼠NR2B亞基RTPCR檢測結果(略)
          Sze等報道,采用RTPCR技術證實9位AD患者死后大腦中NR2A和NR2B亞基mRNA的水平在海馬和內嗅皮質中是降低的,NR1亞基的mRNA水平在受試者的三個腦區中是相似的,在小腦,三種亞基的mRNA水平卻未見減少,且這種變化是與年齡和死后延擱無關[12]。
          本實驗研究結果表明,NR1,NR2A和NR2B的蛋白水平和mRNA水平在鉛暴露大鼠的額葉皮質、海馬、新小腦和紋狀體中均是降低的。表明在鉛暴露大鼠中,NMDA受體亞基NR1,NR2A和NR2B的表達在mRNA水平就已經發生了改變,為進一步研究降低的NR1,NR2A和NR2B亞基水平和學習和記憶能力降低之間的聯系,探索NMDA受體亞基在學習和記憶中的作用,提供了理論依據。
        【參考文獻】
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