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        鉛對大鼠海馬CA1和CA3區Bcl  2陽性細胞影響

        【摘要】  目的 了解海馬各區Bcl2陽性細胞在鉛神經毒機制中的作用。方法 采用免疫組化(ABC)法觀察腹腔注射130mg/kg醋酸鉛溶液大鼠12和24h后海馬CA1區和CA3區Bcl2陽性細胞數目的變化。結果 染鉛12和24h大鼠海馬CA1區Bcl2陽性細胞數目(分別為126.05±33.21和(57.45±37.66)與對照組比較(201.94±31.72)明顯減少(P>0.05,或P<0.01),但各組大鼠海馬CA3區及其他組的CA1區Bcl2陽性細胞數與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。結論 染鉛大鼠海馬CA1區Bcl2陽性細胞數目減少可能與鉛的神經毒作用有關。
        【關鍵詞】  鉛
          有文獻報道,鉛的神經毒性可能和腦細胞凋亡有關〔1,2〕。近年來研究表明,海馬結構各亞區的Bcl2基因表達異?赡苁倾U觸發海馬神經細胞凋亡發生的主要介導因素〔3〕。目前發現,Bcl2(B cell lymhona/leuRenia2)基因在細胞凋亡調控過程中起著重要作用,Bcl2蛋白不僅具有抗淋巴細胞凋亡作用,也具有抗神經細胞凋亡的作用〔3〕。張榮〔4〕等采用流式細胞儀研究發現,染鉛與腦細胞發生凋亡率有劑量反應關系,與Bcl2含量呈現負相關。但染鉛對海馬不同亞區Bcl2蛋白表達的影響,目前尚不清楚。本研究采用免疫組化法觀察染鉛不同時點大鼠海馬CA1區和CA3區Bcl2陽性細胞數目的動態變化,以了解鉛對海馬各區細胞的影響。
          1  材料與方法
          11  實驗動物及處理  選用剛斷乳健康Wistar大鼠30只,雌雄各半(天津市勞動衛生研究所)。自由飲水、普通飼料適應性喂養3d。隨機分為對照組和染鉛3,6,12和24h組共5組,每組6只(雌雄各半),一次性腹腔注射進行染毒:(1)染鉛組:130mg/(kg·bw)的醋酸鉛水溶液;(2)對照組:等體積09% NaCl。
          12  實驗方法 
          121  取材和切片  染鉛組大鼠分別于染毒3,6,12,24h結束時腹腔注射戊巴比妥鈉(60mg/kg)麻醉,開胸,夾閉腹主動脈,經左心室插管,用37℃生理鹽水100~150ml快速沖洗后,以含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液(PBS)(01mol/L,pH74)灌注固定,迅速取腦后,置多聚甲醛中繼續固定7~9h(4℃),移入20%蔗糖溶液浸泡12h以上。恒冷箱連續冰凍切片(片厚為50μm),進行Bcl2免疫組化反應。
          122  Bcl2免疫組化反應  切片移入37℃ TritonH2O2中反應30min,PBS緩沖液漂洗后以3%正常羊血清封閉30min,然后加Bcl2一抗(1:200),4℃溫盒內孵育72h后,免疫組化法(ABC)顯色,常規裱片,脫水,透明,封片。
          123  結果判斷  Bcl2陽性細胞顯棕色或棕色反應顆粒,不顯色為陰性反應;以Bcl2陽性的癲癇大鼠海馬切片為陽性對照,以正常羊血清代替Bcl2一抗作為對照,結果為陰性反應;以01mol/LPBS(pH 74)代替Bcl2一抗為空白對照,結果為陰性反應。
          124  Bcl2陽性細胞計數  每組選取對應斷面的海馬腦片15張(每只動物取2~3張),采用尺型計數器在相同放大倍數(×200)的光鏡下,分別計數CA1和CA3區每毫米的陽性細胞數。
           13  統計分析  采用SPSS80軟件進行分析。
          2  結果
          21  不同染鉛時間海馬區光鏡下觀察結果  光鏡下,海馬結構各區存在Bcl2反應陽性神經元;染鉛3h時,海馬各亞區均無明顯變化;染鉛6h時,海馬CA1和CA3區Bcl2陽性細胞顯色稍加深,陽性細胞數有所增加;染鉛12h時,海馬CA1區陽性細胞顯色明顯變淺,陽性細胞數明顯減少,而CA3區未見明顯變化;染鉛24h,海馬CA1區與12h比較Bc12陽性細胞顯色加深,陽性細胞數漸增多,但較對照組的陽性細胞數少,顯色強度弱,而CA3區未見明顯變化。
          22  不同染鉛時間海馬區陽性細胞數組間比較(表1) 
          表1  不同染鉛時間大鼠海馬各區Bcl2陽性細胞數比較(略)
          注:與對照組比較,* P<005,** P<001;腦片數=15
          3  討論
          有報道〔2,4〕,染鉛大鼠大腦皮層、海馬和小腦細胞凋亡率均明顯高于對照組,Bcl2蛋白是一種神經保護蛋白,其抗凋亡作用與其抗氧化作用有關〔5〕。張榮等發現,大鼠染鉛5d后,皮層、海馬和小腦Bcl2基因表達下降,Bcl2含量與染鉛劑量呈相關〔4〕。鑒于細胞凋亡對于胚胎發育、維持細胞總體數量等過程都具有重要作用,所以腦細胞的凋亡必然會對中樞神經的結構和功能造成損傷。鉛對于海馬不同亞區神經元的代謝及功能如LTP的影響不同〔6〕,推測鉛對海馬不同亞區Bcl2陽性細胞的影響可能不同。進一步研究染鉛對海馬不同亞區Bcl2蛋白表達的影響,將對深入了解鉛干擾學習記憶機制提供重要依據。本研究于大鼠染鉛12h后,觀察到海馬CAl區Bcl2陽性細胞數目明顯減少(P<001),24h時仍處于較低水平(P<005),而在不同時間染鉛組與對照組間海馬CA3區Bcl2陽性細胞數差異已無統計學意義(P>005)。鉛的神經毒性作用尤其是對學習記憶影響的機制相當復雜,鉛對海馬不同亞區Bcl2蛋白表達的不同影響僅僅是其分子機制的一個環節,完全闡明鉛神經毒性,尤其是對學習記憶影響的機制尚需深入研究,但鉛對海馬不同亞區Bcl2蛋白表達的不同影響說明其作用機制與海馬CAl區細胞凋亡保護基因的蛋白表達水平下調有關。【參考文獻】
           〔1〕 Savolainen KM,Eerikainon S.Interaction of excitatory neruotransmitters and denobiotics in excitotoxicity and oxidative stress[J].Glutamate and Lead Toxicol Lett,1998,102:363-367.
          〔2〕 Oberto A,Marks N,Evans HZ,et al.Lead(Pb2+)promates apoptosis in newborn rat cerebral neurons:pathological implications[J].J Pharmacol Exp Ther,1996,279(1):435-442.
          〔3〕 Hockenbery D,Nunez G,Milliman C,et al.Bcl2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death[J].Nature,1990,348(6299):334-336.
          〔4〕 張榮,牛玉杰,程云會,等.醋酸鉛對大鼠腦細胞凋亡及bcl2基因表達的影響[J].中華勞動衛生與職業病雜志,2000,18(4):232-234.
          〔5〕 Vaux DL.Toward an understaning of the molecular mechanisms of physiologcal cell death[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(3):786-791.
          〔6〕 王靜,李積勝,張進,等.鉛對大鼠海馬一氧化氮合酶活力表達的影響[J].中華勞動衛生職業病雜志,2000,18(4):204-206.

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